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目次

1.Motivation
2.非侵襲性投与法の開発
3.粘膜ワクチンの開発
4.癌ターテイング法の開発
5.TJ Modulatorの創製と創薬への応用
6.C型肝炎治療法の開発



 Motivation


60兆個の細胞からなる個体は上皮細胞層により生体内外に区別され、さらに生体内では上皮細胞層および血管内皮細胞層によって脳、血管、腎臓などのコンパートメントが形成されている。コンパートメント内の恒常性を維持するためには内外の物質移動を制御することが不可欠であり、上皮細胞層や血管内皮細胞層は、生体内外および組織内外を隔てるバリアとして機能することにより、恒常性維持に深く関わっている。これらの細胞層では、隣接する細胞間に tight junction(TJ)が発達しており、TJによって細胞間隙はシールされ物質の漏れが抑制されている。70年代にはTJがストランド様の構造をしていることが見出されていたものの、TJ分子基盤は長年に渡り不明なままであった[1]。93年、京大月田承一郎博士のグループによりTJ構成蛋白質として occludinが同定されTJが蛋白質で構成されていることが初めて明らかにされた[2]。さらに98年に、同グループによりTJバリアの機能本体としてclaudinが同定された[3]。Claudinは24種の分子からなるfamilyを形成しており、細胞間隙におけるホモフィリック/ヘテロフィリックな結合によりTJをシールしていると考えられている[4, 5]。興味深いことにバリア機能には組織特異性が認められ、claudin-1は皮膚バリア、claudin-5は血液脳関門バリア、claudin-11は血液精巣関門バリアを担っており、claudinを利用した新規薬物送達法開発の可能性が強く示唆されている[6-8]。また、悪性腫瘍の90%を占める上皮癌では多くの癌種でclaudinの発現異常が観察されており、claudinは上皮癌の創薬ターゲットとしても衆目を集めている[10, 11]。さらに、claudinが粘膜免疫組織で高発現していること、occludinおよびclaudinがC型肝炎ウイルスの感染受容体であることも 報告されており、TJ分子基盤を利用した粘膜ワクチンおよび感染阻害薬創出の可能性も見出されている[12,13]。このように、月田グループによる occludinおよびclaudinの発見に端を発した上皮細胞バリア研究の進展に伴い、従来までの「上皮細胞バリア=物質透過障壁」という概念に加え「上皮細胞バリア分子基盤=創薬ターゲット」という新たな萌芽が生まれつつある。
  当研究グループでは、上述した本邦発の新規創薬ターゲット、上皮細胞バリア制御分子claudinを用いた創薬研究(薬物送達法、粘膜ワクチン開発、癌ターゲティング法の開発、炎症性疾患に対する治療法の開発など)を実施している。
 
引用文献)
1)Staehelin LA: Furtherobservations on the fine structure of freeze-cleaved tight junctions. J Cell Sci 13: 763-786, 1973.
2)Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S, Tsukita S: Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol 123: 1777-1788,1993.
3)Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto F, Tsukita S: Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol 141: 1539-1550, 1998.
4)Furuse M, Sasaki H, Tsukita S: Manner of interaction of heterogeneous claudin species within and between tight junction strands. J Cell Biol 147: 891-903, 1999.
5)Furuse M, Tsukita S: Claudins in occluding junctions of humans and flies. Trends Cell Biol 16:181-188, 2006.
6)Furuse M, Hata M, Furuse K, Yoshida Y, Haratake A, Sugitani Y, Noda T, Kubo A, Tsukita S: Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier: a lesson from claudin-1-deficient mice. J Cell Biol 156: 1099-1111, 2002.
7)Gow A, Southwood CM, Li JS, Pariali M, Riordan GP, Brodie SE, Danias J, Bronstein JM, Kachar B, Lazzarini RA: CNS myelin and sertoli cell tight junction strands are absent in Osp/claudin-11 null mice. Cell 99: 649-659, 1999.
8)Nitta T, Hata M, Gotoh S, SeoY, Sasaki H, Hashimoto N, Furuse M, Tsukita S: Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol 161: 653-660, 2003.
9)Kominsky SL: Claudins: emerging targets for cancer therapy. Expert Rev Mol Med 8: 1-11, 2006.
10)Morin PJ: Claudin proteins inhuman cancer: promising new targets for diagnosis and therapy. Cancer Res 65: 9603-9606, 2005.
11)Tamagawa H, Takahashi I, Furuse M, Yoshitake-Kitano Y, Tsukita S, Ito T, Matsuda H, Kiyono H: Characteristics of claudin expression in follicle-associated epithelium of Peyer's patches:preferential localization of claudin-4 at the apex of the dome region. Lab Invest 83: 1045-1053, 2003.
12)Evans MJ, von Hahn T, Tscherne DM, Syder AJ, Panis M, Wolk B, Hatziioannou T, McKeating JA, Bieniasz PD, Rice CM: Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step inentry. Nature 446: 801-805, 2007.
13)Ploss A, Evans MJ, Gaysinskaya VA, Panis M, You H, de Jong YP, Rice CM: Human occludin is a hepatitis C virusentry factor required for infection of mouse cells. Nature 457: 882-886, 2009.


上皮細胞層は生体内外を隔てる障壁として機能しており、薬物吸収に際しては上皮細胞層の透過が不可欠となっている。既に30年余りに渡り上皮細胞バリアを利用した創薬研究として吸収促進剤が研究されてきており、EDTA、オレイン酸、NO供与剤、カプリン酸ナトリウムなどが吸収促進活性物質として見出されている。それぞれの作用点は細胞間隙に存在するカルシウムイオン、細胞膜、phospholipase C等であり、TJの開口を通じて吸収促進効果を発揮すると考えられている。これらアプローチが研究開発されていた1980年~1998年にはTJ構成蛋白質は未解明であり、吸収促進作用に組織特異性が乏しいこと、TJの開口に伴い薬物以外の物質の非特異的な流入が生じることなどから、臨床応用されている吸 収促進剤はカプリン酸ナトリウムなどにすぎない[1]。
  当研究グループでは、上述した吸収促進剤の有する課題はTJを利用した薬物送達法の限界を示しているのではなく、TJの分子基盤に立脚したアプローチが採られてこなかったことに起因していると考え、上述した吸収促進剤を第一世代のTJ modulatorと定義し、TJの分子基盤に立脚した第二世代のTJ modulatorを利用した薬物送達研究を進めてきた[2]。
   1993年、京大月田グループによりTJ構成蛋白質として4回膜貫通蛋白質occludinが見出され、TJが蛋白質によって構成されていることが初めて明らかにされた。しかしながら、occludinを欠損させても、機能的、構造的に正常なTJが構成されていたことから、occludinはTJバリア機能分子ではないことが示唆された[3]。この報告とほぼ時を同じくして、1998年に新たなTJ構成蛋白質claudinが見出されている[4]。 Claudinは分子量23kDaの4回膜貫通蛋白質であり、現在までに24種類の分子が見出されている。非常に興味深いことに、発現およびバリア機能には組織特異性が認められ、claudin-1欠損マウスでは重層上皮細胞のバリア機能が異常をきたし分子量600程度の分子が皮膚を透過し、 claudin-5欠損マウスでは血液脳関門を分子量800程度の分子が通過する[5]。さらに、claudin-11は血液精巣関門バリアを担っている ことも明らかにされている。これらの報告はclaudinを分子特異的に制御することができれば新たな薬物送達法の開発に繋がることを意味している。 



現在のところ、claudinのバリア機能を阻害する分子としてはウエルシュ菌エンテロトキシン(CPE)のC末断片(C-CPE)のみがclaudin-4のバリア機能を阻害する分子として知られていた[6]。そこでC-CPEをclaudin modulatorのモデル分子として用いて、claudinを利用した薬物送達法創出の可能性について検証を試み、C-CPEがカプリン酸ナトリウムの400倍もの粘膜吸収促進活性を有すること、claudin-4結合能を消失させたC-CPE変異体では吸収促進活性を持たないことを見出し、claudinを利用した粘膜吸収促進法は初めて開発した[7]。さらに、C-CPEを改変することでペプチド医薬の経鼻・経肺吸収促進法の創出にも成功している[8]。また、C-CPEを prototypeとして用いた各種claudin modulator創製を図るために、C-CPEの機能ドメインを同定し、機能ドメインをランダムなアミノ酸に置換したC-CPEライブラリを構築している[9-12]。既に本ライブラリを用いたスクリーニングにより新規claudin binderの作製に成功している[特許出願中]。今後は、これら独自のclaudin modulator研究成果を有効活用することで、新規非侵襲性投与法の開発を進めていく予定である。
 
引用文献)
1) Aungst BJ: Intestinal permeation enhancers. J Pharm Sci 89: 429-442, 2000.
2) Kondoh M, Yoshida T, KakutaniH, Yagi K: Targeting tight junction proteins-significance for drug development. Drug Discov Today 13: 180-186, 2008.
3) Saitou M, Fujimoto K, Doi Y, Itoh M, Fujimoto T, Furuse M, Takano H, Noda T, Tsukita S: Occludin-deficient embryonic stem cells can differentiate into polarized epithelial cells bearing tight junctions. J Cell Biol 141: 397-408, 1998.
4) Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto F, Tsukita S: Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol 141: 1539-1550, 1998.
5)Furuse M, Tsukita S: Claudins in occluding junctions of humans and flies. Trends Cell Biol 16 :181-188, 2006.
6) Sonoda N, Furuse M, Sasaki H, Yonemura S, Katahira J, Horiguchi Y, Tsukita S: Clostridium perfringens enterotoxinfragment removes specific claudins from tight junction strands: Evidence for direct involvement of claudins in tight junction barrier. J Cell Biol 147:195-204, 1999.
7) Kondoh M, Masuyama A,Takahashi A, Asano N, Mizuguchi H, Koizumi N, Fujii M, Hayakawa T, Horiguchi Y,Watanbe Y : A novel strategy for the enhancement of drug absorption using a claudin modulator. Mol Pharmacol 67: 749-756, 2005.
8) Uchida H, Kondoh M, Hanada T,Takahashi A, Hamakubo T, Yagi K: A claudin-4 modulator enhances the mucosal absorption of a biologically active peptide. Biochem Pharmacol, 79:1437-1444, 2010.
9) Takahashi A, Komiya E, Kakutani H, Yoshida T, Fujii M, Horiguchi Y,Mizuguchi H, Tsutsumi Y, Tsunoda S, Koizumi N, Isoda K, Yagi K, Watanabe Y, Kondoh M: Domain mapping of a claudin-4 modulator, the C-terminal region of C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin, by site-directed mutagenesis. Biochem Pharmacol,75:1639-1648, 2008.
10) Harada M,Kondoh M, Ebihara C, Takahashi A, Komiya E, Fujii M, Mizuguchi H,Tsunoda S, Horiguchi Y, Yagi K, Watanabe Y: Role of tyrosine residues in modulation of claudin-4 by the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin. Biochem Pharmacol, 73:206-214, 2007.
11) Ebihara C, Kondoh M, HaradaM, Fujii M, Mizuguchi H, Tsunoda S, Horiguchi Y, Yagi K, Watanabe Y: Role of Tyr306 in the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin for modulation of tight junction.Biochem Pharmacol, 73:824-830, 2007.
12) Takahashi A, Kondoh M, Masuyama A, Fujii M, Mizuguchi H, Horiguchi Y, Watanabe Y: Role of C-terminal regions of the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin in its interaction with claudin-4. J Control Release, 108:56-62, 2005.



2003年に腸管粘膜免疫組織パイエル板を覆う上皮細胞にclaudin-4が高発現していることが見出され[1]、claudinを標的とした粘膜ワクチン開発の可能性が示唆されていたものの、claudinbinderの開発が著しく立ち遅れており、claudinを標的としたワクチン開発は皆無で あった。
  そこで当研究グループでは、C-CPEをclaudin binderのモデル分子として利用し、claudinを利用した粘膜ワクチン開発を試みた。卵白アルブミン(OVA)をモデル抗原として利用したとこ ろ、OVAとC-CPEとの融合蛋白質を経鼻に投与すると血中、糞便中、鼻腔洗浄液中のOVA特異的抗体価の上昇が観察された。OVAとC-CPEの混合液投与、およびclaudin-4結合領域欠損体との融合蛋白質投与では抗体価は上昇しなかったことから、claudinを標的とした粘膜ワクチン開発の可能性を初めて見出した[2, 3]。
  現在、当該研究成果を基に感染症予防ワクチンへの応用を試みている。
 
引用文献)
1) Tamagawa H, Takahashi I, Furuse M, Yoshitake-Kitano Y, Tsukita S, Ito T, Matsuda H, Kiyono H: Characteristics of claudin expression in follicle-associated epithelium of Peyer's patches:preferential localization of claudin-4 at the apex of the dome region. Lab Invest 83: 1045-1053, 2003.
2) Kakutani H, Kondoh M, Fukasaka M,Suzuki H, Hamakubo T, Yagi K: Mucosal vaccination using claudin-4 targeting. Biomaterials,31: 5463-5471, 2010.
3) Suzuki H, Kakutani H, Kondoh M, Watari A, Yagi K: The safety of amucosal vaccine using the C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin. Pharmazie 10(2010)766-769.

癌ターテイング法の開発

従来の生体バリアを利用した創薬研究は薬物吸収促進に焦点が当てられてきた。2000年以降、悪性腫瘍(年間死者数700万人)の90%を占める上皮由来の癌とclaudinとの関連性についても多方面から研究が進み、卵巣癌、膵臓癌、膀胱癌等12種類余りの癌におけるclaudinの高発現が見出され、claudinが癌ターゲティングの標的分子としても注目されている[1, 2]。
  さて、正常な上皮細胞層では細胞の極性が保たれ、水平方向に細胞は分裂しコンタクトインヒビッションにより細胞増殖は制御されている。一方、上皮細胞が癌化すると細胞の極性が崩壊し、細胞分裂軸が回転し垂直方向への分裂が始まり、コンタクトインヒビッションがかからず腫瘍組織を形成していく可能性が示唆されている。この癌化早期イベントである極性の崩壊を利用した癌治療戦略を構築することができれば、癌の早期診断・早期治療法の開発に繋がると予想される。
  当研究グループでは、極性の崩壊に伴いlateral面からapical面に露出するTJ構成蛋白質claudinを利用した新規癌治療法の開発を目指し、claudin-4 binderを利用した癌治療戦略の構築を試みている[3-6]。まず、claudin指向性抗癌剤のモデルとして、claudin-4結合分子C-CPEと緑膿菌由来の蛋白質合成阻害因子(PSIF)との融合蛋白質を作製した。C-CPE-PSIFはclaudin-1、-2、-5発現L細胞では 10 ng/mlでも全く細胞障害性を示さないのに対して、claudin-4発現L細胞では1 ng/ml処理でも顕著な細胞毒性を発揮していた。さらに、Caco-2細胞の単層膜培養系にapical側、もしくはbasal側からC-CPE-PSIFを添加したところ、C-CPE-PSIFをbasal側から加えたときのみ細胞毒性が観察され、C-CPEはclaudinの局在性を認識する新 しいタイプの抗癌活性分子であると推察された[3]。また、マウス乳癌由来細胞株4T1細胞を用いてC-CPE-PSIFの抗腫瘍効果を解析したところ、 C-CPE-PSIF処理でin vitroおよびin vivoでの抗腫瘍活性が認められ体重減少等の副作用は観察されず、claudin-4結合性を消失させた変異体ではin vitro、およびin vivo抗腫瘍活性が共に消失していた[3]。また、興味深いことに、C-CPE-PSIFは癌転移に対しても抑制作用を示していた[6]。
  これらの結果を踏まえ、現在当研究グループでは、癌化の早期イベント「極性の崩壊」を標的とした新規癌診断法・治療法の開発を目指し、新規claudin binderの創出、既存のclaudin binderのプローブ化、最適化などを進めている。
 
引用文献)
1)Kominsky SL: Claudins: emerging targets for cancer therapy. Expert Rev Mol Med 8: 1-11,2006.
2)MorinPJ: Claudin proteins in human cancer: promising new targets for diagnosis and therapy. Cancer Res 65: 9603-9606, 2005.
3) Saeki R, Kondoh M, Kakutani H, Tsunoda S, Mochizuki Y, Hamakubo T, Tsutsumi Y, Horiguchi Y, Yagi K: A novel tumor-targeting using a claudin-4-targeting molecule. Mol Pharmacol, 76: 918-926, 2009.
4) Kakutani H, Kondoh M, Saeki R, Fujii M,Watanabe Y, Mizuguchi H, Yagi K: Claudin-4-targeting of diphtheria toxin fragment A using a C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin. Eur J Pharm Biopharm, 75, 213-217, 2010.
5) Saeki R, Kondoh M, Uchida H, Yagi K: Potency of claudin-targeting as antitumor therapy. Mol Cell Pharmacol, 2: 47-51, 2010.
6) Saeki R, Kondoh M, Kakutani H, Matsuhisa K, Takahashi A, Suzuki H, Kakamu Y, Watari A, Yagi K: A claudin-targeting molecule as an inhibitor of tumor metastasis.J Pharmacol Exp Ther, 334, 576-582, 2010.


Tight junctionを標的とした創薬研究では、tight junctionバリアを自由自在に制御する方法論の確立が必要不可欠である。そこで独自のclaudin binderスクリーニング系などを創製し[1]、低分子化合物、ペプチド、蛋白質などの新規tight junction  modulatorの創製、創薬への応用研究も進めている。詳細については、直接お問い合わせください。

引用論文)                                                1) Kakutani H, Takahashi A, Kondoh M, Saito Y, Yamaura T, Sakihama T, Hamakubo T, Yagi K: A novel screening system for claudin binder using baculoviral display. PLoS ONE 6 (2011) e16611.

C型肝炎治療法の開発

さらに現在、独自のC型肝炎ウイルス感染評価系[1]、幹細胞研究、さらに生体バリアを利用した創薬研究基盤を融合することで、C型肝炎ウイルスに対する治療法開発に向けた研究にも着手している。詳細については、直接お問い合わせください。

 引用論文)                                                1) Yoshida T, Kondoh M, Ojima M, Mizuguchi H, Yamagichi Y, Sakamoto N, Yagi K: Adenovirus vector-mediated assay sytem for Hepatitis C virus replication. Nucleic Acid Res 6(2011) e16611.

 
 

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生体機能分子化学分野

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